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菌株反复冻存对菌株有什么影响？
点击次数：340 发布时间：2022/11/30 10:48:02
菌株反复冻存对菌株有什么影响？低温会使菌株细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。
细胞体积大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。如果放到低温（不是一般冰箱）进行冷冻时，会产生冰晶，冰晶呈针状，易导致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔，当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会变大，故反复冻存，会对菌株造成大损伤。
菌株保存要求
菌种作为一项重要的生物资源，对微生物学教学和研究是必不可少的。菌种保存方法因微生物的不同而异。在菌种保存过程中，必须使微生物的代谢处于不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，故菌种保存方法多依据这三个因素而设计。
菌种保存方法有多种，理想的为真空冷冻干燥法，具有保存时间长、成活率高、变异小等优点，但操作技术难度大，花费高，需特殊设备，一般单位不易做到，而一些常规方法，常因传代次数多、易污染、易变异，给保存带来诸多不利。
多年来，微生物学工作者们一直在研究摸索简便而行之有效的菌种保存方法，岑特生物总结了几种方法简便、效果好的保存方法，现介绍如下。
需要4℃冰箱保存的保存法
1、液体石蜡保存法
先将液体石蜡灭菌，然后放于37℃恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将需要保存的菌种在适宜的斜面培养基中培养，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，用量以高出斜面顶端1cm 为准。试管需直立，置4℃或室温下保存，一般无芽胞细菌可保存1年左右。
2、高层半固体琼脂石蜡保存法
将需保存的菌种经平板划线分离后，挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高层半固体琼脂培养基中，经37℃12小时培养后取出，用无菌操作将灭菌的液体石蜡滴加半固体琼脂菌种管表层约0.5cm高度，存放4℃冰箱，1年转种1次。
3、蒸馏水保存法
取灭菌蒸馏水6-7ml加于试管斜面上，用吸管研磨，洗下菌苔充分混匀，将此菌液分装于灭菌的螺旋小瓶中，或用胶塞密封，置4℃保存可存活数年。
需-20℃冰箱冷冻保存的保存法
1、甘油保存法
甘油一生理盐水保存液的制备：取甘油(分析纯)8份加入生理盐水2份，充分混合后，经121.3℃ 30分钟灭菌备用。
将纯化后的菌株根据菌种不同分别划线接种于其适宜生长的培养基上培养后，用接种针取典型菌落接种肉汤管37℃培养6-8小时(链球菌和奈瑟氏菌接种血清肉汤管，5-10%CO2环境下8-10小时培养，真菌直接用接种环取菌洗入肉汤管，不培养)。此为培养液。
将此培养液与保存液以5：2的比例混合分装于灭菌的微量离心管，置-20℃冰箱保存(链球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用时需37℃水浴中快速解冻。
用上述方法保存一般菌株可存活3年以上，链球菌、奈瑟菌可存活12-15个月，且性状未发生变异。此方法采用幼龄肉汤培养物效果好，且适用于链球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种。
2、低温保存法
菌种保存液的配制：K2HPO4 12.6g，柠檬酸钠0.98g，MgSO4·7H2O 0.18g，KH2PO4 3.6g，甘油88g加蒸馏水至1000mL，103.4KPa灭菌30分钟，4℃保存备用。
将细菌接种于肉汤培养基中，37℃ 培养16-18小时，或斜面培养物刮取于生理盐水中，然后加入等体积的菌种保存液，冻存于-70℃或-20℃冰箱中。
此方法也适合甲链、肺球、流感杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌等耐受力低的细菌。-70℃保存10年以上，-20℃可保存2年以上。
3、细菌湿种牛奶冻存法
新鲜牛奶或15%奶粉煮沸，冷却脱脂，分装小试管，每管1ml，8磅15分钟灭菌备用。
将纯种菌接种于平板，37℃16小时培养，以接种环刮取菌苔2-3环于牛奶中混匀，试管用硅胶塞，冻存于普通冰箱冷冻室(-12℃-18℃)。使用时取出室温溶解，待部分溶解时即可取一环接种平板，并将试管再迅速冻存，这样可反复使用3-5次。此法一般菌株可存活48个月，少数如奈瑟氏菌、甲链、白喉等可存活14-30个月。
4、甘油原液保存法
将各待保存的菌种纯化后用接种环直接从平板上刮取，置于盛有0.5mL甘油原液的菌种瓶中，-20℃保存，可连续52个月存活良好。
此法尤其适合乙链、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌种，是一种简便实用的有效保存方法。
需低温-30或-70℃冰箱保存
1、 脱纤维羊血
无菌抽取羊颈静脉血后，沿瓶壁注入无菌的带玻璃的三角烧瓶中，同时立即同一方向振摇约8-10分钟，脱去纤维，然后分装加盖无菌小试管中约1.0-1.5mL。将脑膜炎双球菌、淋球菌、甲乙型链球菌、肺炎双球菌分别接种于血平板培养基中，两者置于5-10% CO2 烛缸内，经35℃16-18小时培养，后三者置37℃恒温箱培养24小时，然后无菌操作取一接种环菌苔移种于上述新鲜脱纤维羊血试管中，立即置-3O℃冰冻保存二年转种一次。用时室温自然冰融即可接种。
2、 纸片法
新华定性滤纸剪成4mm×4mm，1.5mL带盖离心管消毒灭菌备用，用消毒小钳子钳上滤纸片于平板上刮取待保种的纯菌落2-3个。放于离心管内塞盖再用封口胶布将盖边缘封好放于-30℃冰箱保存。保存12个月后取出菌种解冻后用无菌钳取一片放于肉汤管内37℃培养12小时后转种血平板，性状未变异。
3、 奶粉液菌种保存法
菌种保存液：脱脂奶粉10g，NaCL 10.5g，加双蒸水100mL，121℃ 5分钟高压灭菌后分装于1mL带盖无菌标本杯中(0.5mL)备用。
无菌操作用4mm×10mm 无菌滤纸条蘸取新鲜菌少许，放存含奶粉液保存杯中，盖好，封口胶封口，低温保存。3年存活率达99.2% 。
使用时将标本杯取出，不等全部融化，上层有少许融化即用接种环取一少许接种于血平板分离即可。
细胞体积大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。如果放到低温（不是一般冰箱）进行冷冻时，会产生冰晶，冰晶呈针状，易导致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔，当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会变大，故反复冻存，会对菌株造成大损伤。
菌株保存要求
菌种作为一项重要的生物资源，对微生物学教学和研究是必不可少的。菌种保存方法因微生物的不同而异。在菌种保存过程中，必须使微生物的代谢处于不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，故菌种保存方法多依据这三个因素而设计。
菌种保存方法有多种，理想的为真空冷冻干燥法，具有保存时间长、成活率高、变异小等优点，但操作技术难度大，花费高，需特殊设备，一般单位不易做到，而一些常规方法，常因传代次数多、易污染、易变异，给保存带来诸多不利。
多年来，微生物学工作者们一直在研究摸索简便而行之有效的菌种保存方法，岑特生物总结了几种方法简便、效果好的保存方法，现介绍如下。
需要4℃冰箱保存的保存法
1、液体石蜡保存法
先将液体石蜡灭菌，然后放于37℃恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将需要保存的菌种在适宜的斜面培养基中培养，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，用量以高出斜面顶端1cm 为准。试管需直立，置4℃或室温下保存，一般无芽胞细菌可保存1年左右。
2、高层半固体琼脂石蜡保存法
将需保存的菌种经平板划线分离后，挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高层半固体琼脂培养基中，经37℃12小时培养后取出，用无菌操作将灭菌的液体石蜡滴加半固体琼脂菌种管表层约0.5cm高度，存放4℃冰箱，1年转种1次。
3、蒸馏水保存法
取灭菌蒸馏水6-7ml加于试管斜面上，用吸管研磨，洗下菌苔充分混匀，将此菌液分装于灭菌的螺旋小瓶中，或用胶塞密封，置4℃保存可存活数年。
需-20℃冰箱冷冻保存的保存法
1、甘油保存法
甘油一生理盐水保存液的制备：取甘油(分析纯)8份加入生理盐水2份，充分混合后，经121.3℃ 30分钟灭菌备用。
将纯化后的菌株根据菌种不同分别划线接种于其适宜生长的培养基上培养后，用接种针取典型菌落接种肉汤管37℃培养6-8小时(链球菌和奈瑟氏菌接种血清肉汤管，5-10%CO2环境下8-10小时培养，真菌直接用接种环取菌洗入肉汤管，不培养)。此为培养液。
将此培养液与保存液以5：2的比例混合分装于灭菌的微量离心管，置-20℃冰箱保存(链球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用时需37℃水浴中快速解冻。
用上述方法保存一般菌株可存活3年以上，链球菌、奈瑟菌可存活12-15个月，且性状未发生变异。此方法采用幼龄肉汤培养物效果好，且适用于链球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种。
2、低温保存法
菌种保存液的配制：K2HPO4 12.6g，柠檬酸钠0.98g，MgSO4·7H2O 0.18g，KH2PO4 3.6g，甘油88g加蒸馏水至1000mL，103.4KPa灭菌30分钟，4℃保存备用。
将细菌接种于肉汤培养基中，37℃ 培养16-18小时，或斜面培养物刮取于生理盐水中，然后加入等体积的菌种保存液，冻存于-70℃或-20℃冰箱中。
此方法也适合甲链、肺球、流感杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌等耐受力低的细菌。-70℃保存10年以上，-20℃可保存2年以上。
3、细菌湿种牛奶冻存法
新鲜牛奶或15%奶粉煮沸，冷却脱脂，分装小试管，每管1ml，8磅15分钟灭菌备用。
将纯种菌接种于平板，37℃16小时培养，以接种环刮取菌苔2-3环于牛奶中混匀，试管用硅胶塞，冻存于普通冰箱冷冻室(-12℃-18℃)。使用时取出室温溶解，待部分溶解时即可取一环接种平板，并将试管再迅速冻存，这样可反复使用3-5次。此法一般菌株可存活48个月，少数如奈瑟氏菌、甲链、白喉等可存活14-30个月。
4、甘油原液保存法
将各待保存的菌种纯化后用接种环直接从平板上刮取，置于盛有0.5mL甘油原液的菌种瓶中，-20℃保存，可连续52个月存活良好。
此法尤其适合乙链、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌种，是一种简便实用的有效保存方法。
需低温-30或-70℃冰箱保存
1、 脱纤维羊血
无菌抽取羊颈静脉血后，沿瓶壁注入无菌的带玻璃的三角烧瓶中，同时立即同一方向振摇约8-10分钟，脱去纤维，然后分装加盖无菌小试管中约1.0-1.5mL。将脑膜炎双球菌、淋球菌、甲乙型链球菌、肺炎双球菌分别接种于血平板培养基中，两者置于5-10% CO2 烛缸内，经35℃16-18小时培养，后三者置37℃恒温箱培养24小时，然后无菌操作取一接种环菌苔移种于上述新鲜脱纤维羊血试管中，立即置-3O℃冰冻保存二年转种一次。用时室温自然冰融即可接种。
2、 纸片法
新华定性滤纸剪成4mm×4mm，1.5mL带盖离心管消毒灭菌备用，用消毒小钳子钳上滤纸片于平板上刮取待保种的纯菌落2-3个。放于离心管内塞盖再用封口胶布将盖边缘封好放于-30℃冰箱保存。保存12个月后取出菌种解冻后用无菌钳取一片放于肉汤管内37℃培养12小时后转种血平板，性状未变异。
3、 奶粉液菌种保存法
菌种保存液：脱脂奶粉10g，NaCL 10.5g，加双蒸水100mL，121℃ 5分钟高压灭菌后分装于1mL带盖无菌标本杯中(0.5mL)备用。
无菌操作用4mm×10mm 无菌滤纸条蘸取新鲜菌少许，放存含奶粉液保存杯中，盖好，封口胶封口，低温保存。3年存活率达99.2% 。
使用时将标本杯取出，不等全部融化，上层有少许融化即用接种环取一少许接种于血平板分离即可。
结论
菌种是细菌工作中所不可缺少而又具有传染性生物学因子。为了保/证工作和安全，对菌种必须妥善保存和保管。保存菌种不仅要求不死，还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异，这是保存菌种的重要环节。延长菌种存活期应注意：先，待保存菌种须选择生长/期幼龄培养物，且制成浓菌液保存，以保/证存活率。其次，高层半固体培基/好选择不含或含糖量低的培基，可减少或避免因代谢产物产生而造成的细菌死亡。/后，保存温度的高低可影响存活率，切忌反复冻融。
以上介绍的几种方法，取材简单，操作容易，已经反复实践证明保存时间长，变异小，适合中小型实验室使用。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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