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核酸提取和核酸浓度、纯度的原理及方法
点击次数：252 发布时间：2022/9/1 11:53:02
【实验原理】
DNA是遗传信息的载体,是重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中重要、基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的工作,那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到:1、根据不同研究需要,保证结构的相应完整性；2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。
核酸的提取关键是去除蛋白质,通常情况下,先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后,再用有机溶剂抽提,在单价阳离子存在下,核酸在乙醇中形成沉淀。
作DNA或RNA定量时,应在260nm和280nm两个波长下读数。在260nm的读数用于计算样品中的核酸浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA,40μg/ml单链DNA或RNA及大约20μg/ml单链寡核苷酸。根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度。DNA及RNA纯品的OD260/OD280值分别是1.8和2.0,如果样品中污染有蛋白或酚,其OD260/OD280将明显低于此值,此时无法对样品中的核酸进行精确定量。
【实验用品】
1.台式离心机；电热恒温水浴箱；冰箱；紫外分光光度计；一次性塑料手套。
2.微量加样器(1000μl,200μl,20μl)；Tip头(1000μl,200μl,20μl)。Tip头盒(1000μl,200μl,20μl)；Eppendorff管(2ml,1.5ml,0.5ml),Eppendorff管架。
3.DNA提取的相关试剂:
1)蛋白酶K(10mg/ml),-20℃保存。
2)TE(pH 8.0):10mmol/L Tris.Cl(pH 8.0),1mmol/L EDTA(pH 8.0), 15磅高压灭菌后室温保存。
3)10% SDS:10g SDS溶于90ml 水中,加热68℃助溶,加几滴浓盐酸调节pH至7.2,加蒸馏水定容至100ml,室温保存。
4)3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰乙酸调节pH值至5.2,加水定容至1L,高压灭菌,室温保存。
5)饱和氯化钠,70%乙醇,氯仿
6)饱和酚
【实验步骤】
饱和氯化钠抽提法提取外周血DNA
1.取0.5ml抗凝全血,加入0.8ml TE(pH 8.0)混匀；
2.室温离心,10000rpm ,1分钟；
3.弃上清,加入0.4ml TE(pH 8.0),混匀,悬浮细胞；
4.加入10mg/ml蛋白酶K 5μl(终浓度100μg/ml),10% SDS 25μl(终浓度0.5%),混匀；
5.37℃水浴消化过夜,或50℃消化4小时；
6.加入1/3体积的饱和氯化钠,充分混匀,4℃静置10分钟；
7.10000rpm离心10分钟,取上清于另一新管中；
8.加入等体积氯仿,混匀,10000rpm离心10分钟；
9.取上清于另一新管中,加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2)混匀；
10.加入2倍体积无水乙醇轻轻混合,10000rpm离心1分钟；
11.弃上清,加入70%乙醇0.5ml,充分洗涤；
12.10000rpm离心1分钟,弃上清,自然干燥DNA约5分钟；
13.加入200-250μl TE,-20℃保存；
14.检测浓度及纯度。
酚氯仿抽提法提取外周血DNA
1.外周血反复冻溶破坏红细胞,取0.5ml外周血,加入0.5ml PBS混匀后,10000rpm 离心10分钟；
2.弃上清,加入180μl TE(pH 8.0),20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl(终浓度100μg/ml)混匀；
3.37℃水浴消化过夜,或50℃消化4小时；
4.加入等体积的饱和酚并充分混匀,10000rpm离心10分钟；
5.吸取上清液于另一新管中,重复上一步骤一次；
6.吸取上清液于另一新管中,加入等体积的酚氯仿并充分混匀,10000rpm离心10分钟；
7.吸取上清液于另一新管中,加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2) 混匀后,加入2倍体积无水乙醇并轻轻混合,可见絮状乳白色DNA团块,10000rpm离心10分钟；
8.弃上清,加入70%乙醇0.5ml,充分洗涤；
9. 10000rpm离心1分钟,弃上清,自然凉干后加入TE液,-20℃保存；
10.检测浓度及纯度
组织总RNA的提取
1. 将组织用锡箔纸包裹后于液氮中冻10min,击碎后回收入2ml无菌Eppendorff管中。按50-100mg组织样品加1ml TRIZOL试剂进行组织匀浆,样品体积不应超过TRIZOL试剂体积的10%；
2.将组织匀浆液在15-30℃放置5min,促使核蛋白复合物完全解离,按1ml TRIZOL,加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15s,15-30℃放置2-3min,在2-8℃,离心转速不超过12000g,离心15min,将上清液转入新的离心管中(上清液约占TRIZOL试剂体积的60%)；
3. 在上清液中按1mlTRIZOL试剂(初匀浆体积)加入0.5ml异丙醇混匀,15-30℃放置10min,在2-8℃,离心转速不超过12000g,离心10min；
4. 弃上清,70%乙醇洗涤RNA沉淀 (1ml TRIZOL试剂至少加入1ml 70%乙醇),振荡混匀,在2-8℃,离心转速不超过7500g,离心5min；
5. 室温或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55℃-60℃温浴10min).
6. 紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度；
7. 1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总RNA,每孔上样25μg,65V,2.5h,以检测RNA的质量。
【实验结果分析】
1. 计算已提取的DNA的浓度和纯度
DNA是遗传信息的载体,是重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中重要、基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的工作,那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到:1、根据不同研究需要,保证结构的相应完整性；2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。
核酸的提取关键是去除蛋白质,通常情况下,先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后,再用有机溶剂抽提,在单价阳离子存在下,核酸在乙醇中形成沉淀。
作DNA或RNA定量时,应在260nm和280nm两个波长下读数。在260nm的读数用于计算样品中的核酸浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA,40μg/ml单链DNA或RNA及大约20μg/ml单链寡核苷酸。根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度。DNA及RNA纯品的OD260/OD280值分别是1.8和2.0,如果样品中污染有蛋白或酚,其OD260/OD280将明显低于此值,此时无法对样品中的核酸进行精确定量。
【实验用品】
1.台式离心机；电热恒温水浴箱；冰箱；紫外分光光度计；一次性塑料手套。
2.微量加样器(1000μl,200μl,20μl)；Tip头(1000μl,200μl,20μl)。Tip头盒(1000μl,200μl,20μl)；Eppendorff管(2ml,1.5ml,0.5ml),Eppendorff管架。
3.DNA提取的相关试剂:
1)蛋白酶K(10mg/ml),-20℃保存。
2)TE(pH 8.0):10mmol/L Tris.Cl(pH 8.0),1mmol/L EDTA(pH 8.0), 15磅高压灭菌后室温保存。
3)10% SDS:10g SDS溶于90ml 水中,加热68℃助溶,加几滴浓盐酸调节pH至7.2,加蒸馏水定容至100ml,室温保存。
4)3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰乙酸调节pH值至5.2,加水定容至1L,高压灭菌,室温保存。
5)饱和氯化钠,70%乙醇,氯仿
6)饱和酚
【实验步骤】
饱和氯化钠抽提法提取外周血DNA
1.取0.5ml抗凝全血,加入0.8ml TE(pH 8.0)混匀；
2.室温离心,10000rpm ,1分钟；
3.弃上清,加入0.4ml TE(pH 8.0),混匀,悬浮细胞；
4.加入10mg/ml蛋白酶K 5μl(终浓度100μg/ml),10% SDS 25μl(终浓度0.5%),混匀；
5.37℃水浴消化过夜,或50℃消化4小时；
6.加入1/3体积的饱和氯化钠,充分混匀,4℃静置10分钟；
7.10000rpm离心10分钟,取上清于另一新管中；
8.加入等体积氯仿,混匀,10000rpm离心10分钟；
9.取上清于另一新管中,加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2)混匀；
10.加入2倍体积无水乙醇轻轻混合,10000rpm离心1分钟；
11.弃上清,加入70%乙醇0.5ml,充分洗涤；
12.10000rpm离心1分钟,弃上清,自然干燥DNA约5分钟；
13.加入200-250μl TE,-20℃保存；
14.检测浓度及纯度。
酚氯仿抽提法提取外周血DNA
1.外周血反复冻溶破坏红细胞,取0.5ml外周血,加入0.5ml PBS混匀后,10000rpm 离心10分钟；
2.弃上清,加入180μl TE(pH 8.0),20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl(终浓度100μg/ml)混匀；
3.37℃水浴消化过夜,或50℃消化4小时；
4.加入等体积的饱和酚并充分混匀,10000rpm离心10分钟；
5.吸取上清液于另一新管中,重复上一步骤一次；
6.吸取上清液于另一新管中,加入等体积的酚氯仿并充分混匀,10000rpm离心10分钟；
7.吸取上清液于另一新管中,加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2) 混匀后,加入2倍体积无水乙醇并轻轻混合,可见絮状乳白色DNA团块,10000rpm离心10分钟；
8.弃上清,加入70%乙醇0.5ml,充分洗涤；
9. 10000rpm离心1分钟,弃上清,自然凉干后加入TE液,-20℃保存；
10.检测浓度及纯度
组织总RNA的提取
1. 将组织用锡箔纸包裹后于液氮中冻10min,击碎后回收入2ml无菌Eppendorff管中。按50-100mg组织样品加1ml TRIZOL试剂进行组织匀浆,样品体积不应超过TRIZOL试剂体积的10%；
2.将组织匀浆液在15-30℃放置5min,促使核蛋白复合物完全解离,按1ml TRIZOL,加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15s,15-30℃放置2-3min,在2-8℃,离心转速不超过12000g,离心15min,将上清液转入新的离心管中(上清液约占TRIZOL试剂体积的60%)；
3. 在上清液中按1mlTRIZOL试剂(初匀浆体积)加入0.5ml异丙醇混匀,15-30℃放置10min,在2-8℃,离心转速不超过12000g,离心10min；
4. 弃上清,70%乙醇洗涤RNA沉淀 (1ml TRIZOL试剂至少加入1ml 70%乙醇),振荡混匀,在2-8℃,离心转速不超过7500g,离心5min；
5. 室温或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55℃-60℃温浴10min).
6. 紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度；
7. 1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总RNA,每孔上样25μg,65V,2.5h,以检测RNA的质量。
【实验结果分析】
1. 计算已提取的DNA的浓度和纯度
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